Enzymatischer Nachweis
Versuchsprinzip
Der Nachweis erfolgt über die Bildung des sogenannten MTT-Formazan-Komplexes. Hierbei wird das MTT [3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid] von verschiedenen reduzierenden Substanzen wie L-Ascorbinsäure, Glucose, Maltose und Galactose reduziert. Das PMS (5-Methylphenaziniummethylsulfat) dient bei dieser Reaktion als Elektronenüberträger. Die allgemeine Reaktion kann wie folgt formuliert werden:
Ascorbinsäure + X(H2) + MTT + PMS
↓
Dehydroascorbinsäure + x + MTT-Formazan-Komplex
X(H2) stellt hierbei die Gesamtheit aller reduzierenden Stoffe (außer Ascorbinsäure) dar. Aus dieser Reaktion entsteht der MTT-Formazan-Komplex, Dehydroascorbinsäure sowie die Oxidationsprodukte der Glucose, Maltose etc.
Durchführung
Um den Gehalt an Ascorbinsäure zu bestimmen, wird neben der Probelösung in einem Leerwertansatz nur der Ascorbatanteil mit Hilfe der Ascorbatoxidase oxidiert. Anschließend erfolgt die Zugabe von MTT und PMS. Für die Bestimmung werden beide Ansätze gebraucht.
Für die Probelösung gilt nun, dass der MTT-Formazan-Komplex proportional zur Gesamtmenge der reduzierenden Stoffe ist, während beim Leerwertansatz nach der Oxidation zur Dehydroascorbinsäure der MTT-Formazan-Komplex proportional zur Menge der anderen reduzierenden Stoffe ist, da Dehydroascorbinsäure nicht von dem Komplex erfasst wird.
Nun wird die Extinktion des MTT-Formazan-Komplexes (bei beiden Ansätzen) photometrisch bei 578 nm ermittelt. Für die Berechnung des Ascorbinsäureanteils muss die Extinktion des Leerwertansatzes von der Extinktion der Probelösung subtrahiert werden.
Geräte
Waage, 400 ml Becherglas, 50 ml Messzylinder, Stabmixer, pH-Meter, 500 ml Messkolben, Trichter, Filterpapier, 50 ml Becherglas, Eppendorfpipetten (100 µl, 500 µl und 100 µl), Küvetten, Dispensette, Inkubator, UV-Spectrometer, Kochplatte, Kochtopf, Schockkühler, Wasserbad, Thermometer, Stoppuhr
Chemikalien
- meta-Phosphorsäure H3PO4 (Herstellung: 15 g Phosphorsäure-Kristalle auf 100 g mit bidestilliertem Wasser aufgefüllt)
- 2 M Kalilauge KOH
- bidestilliertes Wasser
- MTT [3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid]
- PMS [5-Methylphenaziniummethylsulfat]
« Funktionen der L-Ascorbinsäure